viernes, 29 de enero de 2010

¿Cómo inseminar un camarón?

Dicen que una imagen vale más que mil palabras... así que mejor les muestro a grandes rasgos en qué consistió la parte práctica de mi trabajo de Maestría.
Les explico que los camarones con los que yo trabajo, Penaeus (Litopenaeus) vannamei, cuentan con proceso de apareamiento muy curioso, que consiste en la transferencia del paquete espermático del macho (o espermatóforos) al télico (estructura por donde se lleva a cabo del desove) de la hembra. Por lo tanto, esta especie fertiliza sus huevos externamente.
Los espermatóforos son unas bolsitas con esperma que tienen los machos en la parte inferior del cefalotorax (uno de cada lado), entre los periópodos (patitas para caminar) y los pleópodos (patitas para nadar).
Cuando los camarones se aparean, los machos transfieren los dos espermatóforos en una sola hembra. Por lo que un macho únicamente puede inseminar a una hembra esa vez, y debe esperar a que los espermatóforos se regeneren (unos 10 días), para poder aparearse con otra hembra.

Pero los espermatóforos pueden ser extraídos manualmente sin lastimar al macho. En la foto les muestro como estoy extrayendo uno.
Se debe presionar con cuidado el ámpula, hagan de cuenta que estan presionando para reventar un grano de la cara...
Si extraemos los espermatóforos, entonces podemos colocar uno en cada hembra, con lo que estaremos aumentando el número de hembras inseminadas por macho de una a dos.
Pero como yo trabajo en un núcleo genético, los genetistas requieren de que sea posible generar varias familias de medios hermanos para poder realizar sus evaluaciones genéticas y dos hembras por macho no les brinda mucho margen para trabajar...
Y es aquí donde entro yo en acción: buscando inseminar cuatro hembras por macho a la vez. Pero para ello debía diluir el semen contenido en el espermatóforo.
Entonces, lo que yo hago es tomar al macho, retirar los espermatóforos y presionar cada uno entre los dedos índice y pulgar para separar la masa espermática de una estructura rígida que la rodea, la cual se descarta.
En la imagen se puede observar la estructura rígida separada de la masa seminal.
La masa seminal consiste de plasma seminal, espermatozoides y una sustancia pegajosa, lo que da al conjunto una consistencia de moco espeso. Ese moco es necesario conservarlo porque el semen debe permanecer pegado por fuera de la hembra para llevar a cabo la fertilización.

Lo primero que debí hacer fue diseñar una sustancia extensora que permitiera diluir el semen y obtener varias dosis de un espermatóforo, de modo que con un solo macho se pudieran inseminar varias hembras, pero sin que el semen perdiera adherencia.

En la foto el semen de un espermatóforo ya mezclado con el diluyente en espera de ser utilizado.

Antes de usar el semen, era necesario revisar que los espermatozoides estuvieran almacenados en perfectas condiciones usando el diluyente que elaboré.

Pero eso es un poquito dificil porque los espermatozoides del camarón presentan una particularidad: No tienen flagelo, por lo tanto, no se mueven. Por ese detallito, la viabilidad espermática no se puede llevar a cabo revisando su motilidad, como se hace en otras especies...

Entonces tuvimos que buscar un método alternativo para saber si el diluyente los estaba conservando vivos o muertos, y lo que utilizamos fue una tinción dual fluorescente, que pintaba de verde los espermatozoides vivos y de rojo los muertos.

En la foto pueden observar el mismo grupo de espermatozoides. A la izquierda vista con tinción fluorescente y a la derecha con microscopio de luz visible.

Noten que los espermatozoides de camarón en vez de flagelo, tienen una especie de "espina". Su apariencia recuerda mucho la de una pelota de golf sobre su tee.

Una vez que tenemos claro que el esperma se conserva bien en el diluyente, procedemos a utilizarlo en la inseminación.

Tomamos a una hembra (no se preocupen, los camarones toleran bien la manipulación y pueden estar un rato fuera del agua sin problemas) la ponemos pancita arriba y exponemos el télico.

Colocamos la mitad de esa masa seminal diluida que estaba guardada en el frasquito en el télico con ayuda de unas pinzas, como observan en la foto.

El procedimiento de inseminación se hace en 30 segundos o menos para no estresar a la hembra, de lo contrario, no desova.

Una vez inseminada, la hembra es trasladada a un tambo de desove con 200 litros de agua.

Ahí permanece un par de horas, una vez que desova, se retira de ese tambo y se traslada de vuelta a su tanque de origen.

¿Y qué dijeron? ahí termina el trabajo de Kary... ¡Pues no!

Después de que la hembra desova, hay que incubar los huevos hasta que las larvas de camarón (nauplios) eclosionan.

Una vez terminada la incubación, hay que contar cuantos huevos sin eclosionar y cuantos nauplios dio cada hembra.

Para ello debo concentrar el contenido de cada tambo en cubetas con tamiz de 15 litros, tomar una muestra de esa cubeta y observarla a contraluz para contabilizar la cantidad de nauplios y huevos, lo cual es mas fácil de decir que de hacer...

Primero porque los tambos de desove son individuales, entonces ese procedimiento de voltear el tambo y concentrarlo en la cubeta debe realizarse en tantas hembras como fueron inseminadas (llegamos a inseminar hasta 100 hembras por día).

Y segundo, porque para mantener el agua en la temperatura óptima para conservar vivos a los nauplios, debíamos trabajar dentro de una nave especial con temperatura ambiental de al menos 42 grados centígrados y 85% de humedad relativa ¡un sauna! realmente fue una experiencia muy terapéutica...

Y luego de toooodo ese trabajo físico, a hacer los análisis estadísticos y redactar la tesis...

Y al final ¡tachán! obtuve mi grado de Maestra en Ciencias :D

Abstract

La versión en inglés del resumen, por si en español no quedó claro... :P

The aim of this study was to develop and evaluate an extender solution for short-term storage of Penaeus (Litopenaeus) vannamei sperm to be used in artificial insemination (AI).

The sperm survival percentage was evaluated assessing sperm membrane integrity for 3 different extenders, calcium free artificial sea water (ASW), Hank’s balanced solution with calcium (HBS2), and calcium free Hank’s solution (HBS1), obtaining better results with ASW.

Data were analyzed using mixed linear models and logistic models, showing that sperm survival percentage (standard error) using ASW was 91.6 (30), and did not differ from HBS1 79.6 (31.4) (P>0.05), but was different from HBS2 59.5 (30) (P<0.05). p="0.0065.">

To assess nauplii production using ASW extender, 2 experiments were performed. The first experiment compared two treatments: sperm from half spermatophore (1) diluted with ASW and (2) undiluted, to inseminate four females per male in both treatments. Results showed that diluted semen yielded more nauplii than undiluted semen, with a mean (standard deviation) of 11915 (630) vs. 21589 (1471), respectively (P=0.0086). Female success for nauplii production was 4.9 times larger for diluted than undiluted treatment with 82.9% success when ASW was used.

The second experiment compared 3 treatments: undiluted sperm mass from one spermatophore (MP), same as MP but pouring ASW on it as a humectant (E1), and half sperm mass diluted on ASW (D1),to be used in two different AI male:female ratios 1:2 (MP/E1), and 1:4 (D1). Marginal differences between treatments (MP, D1 y E1) were observed for nauplii yielded (P=0.0992), with a mean (standard deviation) of 5388 (102) for MP, 102 (129) for E1, and 21 (90) for D1.

Using half spermatophore diluted with ASW allowed us to increase the number of females inseminated per male. It was possible to obtain nauplii from four different females per male in almost 86% of the cases, with a mean (standard error) of 3.43 (0.76) fertilized females per male.




El resumen de mi tesis de Maestría

Evaluación de un extensor para el esperma del camarón blanco del Pacífico Penaeus (Litopenaeus) vannamei para su almacenamiento a corto plazo

El objetivo de este estudio fue desarrollar y evaluar un extensor para la conservación a corto plazo del esperma de Penaeus (Litopenaeus) vannamei, y su uso en la inseminación artificial (IA).

Con base en la integridad de la membrana celular de los espermatozoides, se evaluó la sobrevivencia espermática utilizando 3 extensores: agua de mar artificial libre de calcio (ASW), una solución balanceada de Hank con calcio (HBS2) y otra libre de calcio (HBS1), observando mejores resultados al emplear ASW.





Para el análisis se usó un modelo lineal mixto y un modelo logístico que mostraron que el porcentaje (error estándar) de gametos sobrevivientes con ASW fue 91.6 (30) y que éste no fue diferente de HBS1 79.6 (31.4) (P>0.05), pero sí de HBS2 59.5 (30) (P<0.05). p="0.0065),">


Se realizaron dos experimentos para comparar la producción de nauplios con el empleo del extensor seleccionado. El primero comparó dos tratamientos: el esperma de medio espermatóforo diluido en ASW, y el esperma de medio espermatóforo sin diluir, obteniendo para ambos casos una relación de hembras inseminadas por macho de 4:1.


El análisis reveló que el tratamiento utilizando medio espermatóforo diluido con ASW produjo más nauplios, con una media (desviación estándar) de 11915 (630) que medio espermatóforo sin diluir 2159 (1471) (P=0.0086); en relación a la variable binaria éxito por hembra para la obtención de nauplios, se observó que por cada hembra que produjo nauplios con el tratamiento sin extensor 4.9 lo hicieron con el tratamiento con extensor, con un éxito de 82.9% al usar el tratamiento con extensor.


El segundo experimento comparó tres tratamientos: esperma sin diluir de un espermatóforo (MP), igual a MP pero agregando ASW como humectante (E1), y esperma diluido de medio espermatóforo con ASW (D1), obteniendo de esta manera relaciones macho-hembra de 1:2 (MP y E1) y de 1:4 (D1). Se observaron diferencias marginales entre los tres tratamientos (MP, D1 y E1) para el número de nauplios producidos (P=0.0992), obteniéndose una media (desviación estándar) de 5388 (102) para MP, 102 (129) para E1 y 21 (90) para D1.

Se concluye que el uso de ASW con medio espermatóforo permitió incrementar el número de hembras inseminadas por macho, llegándose a obtener descendencia con 4 hembras diferentes del mismo macho, con un promedio (error estándar) de número hembras fertilizadas por macho de 3.43 (0.76).

Agradecimientos

Widescreen (2.35:1) version of the Special Extended Edition

Y aprovecho que aquí no tengo ninguna restricción de espacio (que esa cuartilla en la versión oficial de la tesis no alcanza pa'naa…) para poder extenderme tooooodo cuanto quiera y dar las gracias como a mí se me antoja.

Primero a mis tres tutores de lujo:

Dr. Hugo Montaldo, mi tutor principal. Gracias por su tiempo, paciencia y experiencia académica; por mostrarme la luz en momentos de tormentosa oscuridad en el camino de la investigación y por recibirme siempre con una gran sonrisa y disposición para brindar sus conocimientos.
Dr. Héctor Castillo, mi tutor también en la licenciatura y responsable de que me involucrara en el proyecto. Me faltan palabras para expresarle mi agradecimiento, admiración y cariño. Gracias por el apoyo brindado en cada paso del camino, por sus consejos, los momentos de enseñanza, por ser parte fundamental en mi formación desde el inicio, por la paciencia de santo que demostró tener ante mi nula capacidad de síntesis y por aceptar ser mi tutor ¡de nuevo! en el posgrado.

Dra. Carmen Paniagua, mi tutora y guía en el CICESE. Doy gracias a Dios por haberme permitido conocerla y por haber aceptado ser mi guía en este hermoso camino de la investigación. Muchas gracias por tomarse el tiempo para mostrarme los sitios turísticos de Ensenada, sacrificando para ello sus fines de semana e incluyéndome dentro de sus actividades familiares. Es un gran ejemplo a seguir, la admiro, la respeto y la llevo en mi corazón.

Gracias también a los miembros del Jurado, Dr. Carlos Galina (Profesor Emérito de la FMVZ), Dr. Mauricio Valencia, Dr. Alfredo Medrano y Dr. Gabriel Campos por su tiempo, atención y apoyo.

De Maricultura del Pacífico, S.A. de C.V.

A los Ingenieros Cesáreo Cabrera y Juan Carlos Quintana: Gracias por el financiamiento y el apoyo incondicional brindado durante todas las fases del proyecto; por abrirme siempre las puertas de la empresa dándome todas las facilidades para la realización de la investigación y por la confianza depositada en mi persona.

Gracias también a Rocío Brahms López, la voz y mente detrás de la logística en Mazatlán, siempre al tanto de nuestras idas y venidas, la lista de materiales, las reservaciones, los boletos de avión y cuanto detalle pudiera surgir.

Al fantástico personal que labora en Maricultura. Ha sido todo un honor el que me permitieran aprender y trabajar con Ustedes, espero tengamos oportunidad de repetirlo en el futuro. Y aquí van al detalle los agradecimientos para la gente de Maricultura en Los Pozos…

Al Biólogo Alfonso Martínez Ortega, por todas las facilidades que me brindó tanto en el núcleo genético como en las maduraciones, y por tener la paciencia de permitirme realizar mis experimentos durante los ciclos de producción.
A Esmeralda Tirado Lizárrago, por siempre coordinar nuestras llegadas y salidas, conseguir mis fotocopias, escucharnos, resolvernos la vida y siempre estar al tanto de todo.

A la gente hermosa del comedor: Santa Ramírez Valerio, Ma. Carmen Pimentel Cañedo y Janeth Martínez Salgado por tratarnos tan bien y guardarnos para cenar un poquito del guisado del día cuando nos tocaban quesadillas en el núcleo. A Janeth por siempre esperarnos para la cena, hacernos la plática y dejarnos cargar a su linda bebita.

A todo el personal de las maduraciones que me tuvieron paciencia y me capacitaron formidablemente: Gabriel Siqueiros Solís, Don Manuel de Jesús Hernández Palomares, Florentino Aragón Chávez, José Guadalupe Delgado Rendón y Tomás Flores Copado (quien me mostró rápidamente porque había que acarrear a los camarones usando guantes ¡ouch!).


A los aurigas que nos llevaban a la civilización cuando hacía falta: Renato Tinajero Zamora y Juan Diego Carrillo Benítez.


Al personal del núcleo genético, quienes siempre me recibieron con los brazos abiertos, a pesar que mi presencia les representara más trabajo:

Claudia Esther Ozuna Salgado, Clau, tú siempre feliz y sonriente ¡y esa voz! ¡se te extrañaba cuando estabas de descanso!

Gregorio López Abrego ¡Goyitoooooo! Mi sensei en el arte de inseminar camarones, poseedor de esos ojos de terminator capaces de escanear un tanque de 200 litros y decir en 2 segundos sin margen de error cuantos nauplios tenía ¡wow! siempre con una gran sonrisa y fantásticas ocurrencias fuera la hora que fuera.
Nota. En esta foto Goyito está muy concentrado inseminando con ayuda de Abraham, por eso nos da la espalda...

Socorro Martínez Figueroa, Socorrito del alma, ayudándome siempre a contar nauplios, inseminar, pescar, poner filtros, esterilizar equipo… y encima, hacer su trabajo en el cepario de microalgas ¡que aguante! ¡Gracias por presentarme a tu lindísima familia, tu abuelita es lo máximo!

Jaime Martínez Figueroa, gracias por no dejar de dirigirme la palabra a pesar de mi despiste (pero llevaba los audífonos puestos ¿eh?), por enseñarnos todo del proceso larvario, por prestarnos el coche sabiendo que no sé manejar y por ser tan estupenda persona.

Xochitl Zamora Jara, por siempre estar dispuesta a ayudar y dar cuanta vuelta fuera necesaria hasta la sala de observación porque siempre se nos olvidaba algo…

Irene Guadalupe Zambrano Delgado ¡La more, siempre tan wapa y trabajadora!

En la foto, comenzando desde el frente: Irene, Xochitl y Goyitoooooo!

A Deisi ¡puras de esas! ¿y de las otras? ¡también!

Marco Antonio Aguilar López, Don Toño ¡contándo chistes de Guasave y yo desternillándome de la risa, vientos!

Horacio Tirado Sánchez ¡Don Orange! todo un caballero muy trabajador.


Magdalena López Mendoza, nuestra Mene-Mene-Mene, esas ocurrencias tuyas ¡me mataban! Aquí en su delantal de gala...
Pedro Castillo García ¡Pedrito! gracias por ser tan lindo y siempre pregonar que ¡sólo Veracruz es bello! (y el resto de la frase que por razones obvias no puedo repetir aquí...) donde quiera que me veías.
A todos mis Profesores (de licenciatura y posgrado), quienes me inculcaron el amor hacia la Profesión y de quienes aprendí lo bueno para seguir su ejemplo y me señalaron lo malo, para mejorar día a día.

Al Ingeniero José Luis Pablos Hach por todas sus enseñanzas, no sólo estadísticas, pero también en materia de conciencia y responsabilidad social, es Usted un caballero de gran calidad humana.

A la Dra. Mónica Hernández del CICESE, por ayudarme a acondicionar el tanque de mis camarones, compartir toda su experiencia y por enseñarme a usar el osmómetro.

A mis familiares y amigos por ayudarme a crecer y madurar como persona y por apoyarme en todas las circunstancias posibles, en especial a mi tía Carmelita por estar una hora al teléfono dándome ánimos.

A todos los que me acompañaron en mi examen de grado: Dr. Héctor Castillo, Dr. Jorge Torres, Dr. Luis Pedro Moles, Ale Caballero, Christopher Méndez, Patricia Meléndez ¡Paty adorada del alma! y claro, mi mariadito Gaspar González, quien además se tuvo que fletar mi neurosis de días previos al examen, pero nomás por eso te dediqué la tesis ¿eh? :)
Ah! ¡Y mención de honor al Dr. Torres que de sorpresa nos invitó a celebrar en un restaurante bieeeen bonito! ¡Tottemo wa dai suki desu, domo arigato Torres-san!

A mis compis del posgrado:


Ana Laura Tapia ¡Ranita! por ayudarme en mi proyecto y ser tan extraordinaria compañera de viaje y de laboratorio.



Ángeles Peralta, lo mismo, gracias por aceptar compartir el proyecto camaronesco y por aguantarme de room-mate.




Sergio Avítua (Kalimán) por el apoyo y las enseñanzas en materia de genética molecular.


Marisela Aguilar (Truchita) por enseñarme del manejo de gametos y las tinciones en el CICESE y ser tan siempre amable.



A Erika “Tronina” Trani por ser tan ocurrente, amable y preciosa persona.
Alejandra Pelcastre, por tenerme paciencia cuando yo no entendía nadita en la clase de Diseños, por darme asilo cuando me cerraron la carretera, por dejarme jugar con Alecita y por ser tan buena amiga.


Al increíble personal del Departamento de Posgrado en la Facultad de Veterinaria, todos siempre dispuestos a resolver nuestras dudas y agilizar los trámites.
Al pueblo de México, cuya contribución tributaria hizo posible que el CONACYT me asignara la beca para llevar a cabo esta Maestría ¡Gracias México!

¡Shrimpers!
No estamos todos los que somos, pero si somos todos los que estamos...
El grupo multidisciplinario de camaronicultura, mejor conocido como "Los shrimpers"
De izquierda a derecha: Dr. Gabriel Campos (genetista), Mois (reproducción), Dr. Héctor Castillo (genetista), MVZ Ana Laura Tapia y M en C Sergio Avítua (Biología Molecular)